El Destino del ADN en la Biología Forense

Perfilamiento del ADN y consideraciones de los instrumentos analíticos utilizados para ello 

 


Sinopsis:

El concepto de ciencia forense existe desde la antigüedad. 


En la biología forense moderna, los analistas del ADN utilizan las características únicas de las secuencias (p.e. STRs), para generar perfiles del mismo, exclusivos para cada individuo a partir de evidencia biológica colectada de escenas del crimen, víctimas y sospechosos. Los analistas del ADN forense a menudo requieren superar retos únicos para este campo (p.ej. degradación de ADN, mezcla, transferencia). Así, la selección de los instrumentos de laboratorio aumentan significativamente la capacidad analítica, eficiencia, precisión y reproducibilidad mientras reducen la demanda de la condición de las muestras biológicas, su pureza y cantidad, consecuentemente reduciendo el tiempo crítico necesario para la resolución de los casos criminales. 


Palabras Clave: biología forense, tipificado de ADN, Análisis por STR, NGS, termociclador.


La ciencia forense no es un concepto moderno

Aunque las investigaciones criminales en la antigüedad se basaban en confesiones forzadas y testimonios, existen relatos de varias técnicas que pueden considerarse como precursoras de la ciencia forense formal, tales como; el uso de la autopsia. En un tratado sistemático en medicina forense que data de 1247, en la dinastía Song, se documentan muchos conceptos forenses como la protección de la evidencia, el cálculo del tiempo del deceso, la valoración de la condición del cuerpo, la influencia ambiental, entre otros.  [Lu & Needham, 1988, pg. 357-400].

La sociedad progresa y la ciencia avanza

 

En años recientes, las divisiones de la ciencia forense que más se desarrollan son los campos de la ciencia forense digital, tales como la recuperación de la evidencia desde computadoras y dispositivos móviles, monitoreo y análisis del tráfico de redes, algoritmos computacionales para generar predicciones, así como análisis de grandes cantidades de datos genéticos, para asistir en las investigaciones. La ciencia forense moderna se desarrolló en muchas ramas de divisiones especializadas incluyendo: balística, arte, geología, contabilidad, biología y muchas más.

La división de la biología forense en sí mismo cubre varias disciplinas

Esta rama de la ciencia forense explota el conocimiento biológico con técnicas que obtienen información de varios componentes biológicos. Ya que el ADN es la unidad biológica básica de la vida, el término “biología forense” a menudo se maneja como un sinónimo del análisis del ADN a partir de evidencias biológicas. 


Las muestras biológicas más comunes que llegan a los laboratorios forenses para su análisis son fluidos corporales y tejidos tanto de sospechosos como de víctimas, los fluidos corporales incluyen: sangre, saliva, semen, orina, materia fecal, leche materna y sudor. De manera semejante, los tejidos humanos puede ser células epiteliales (muertas o vivas), cabello (con el folículo piloso intacto), dientes y huesos. Utilizando estas muestras, los analistas del ADN pueden desarrollar un perfil genético utilizando varios métodos.

El perfil de ADN es único para cada individuo

Cada ser humano nace con una secuencia de ADN heredado en partes iguales de sus padres, así términos como ‘Perfil Genético’, ‘Huella Génica’ y ‘Genotipado de ADN’ son utilizadas como sinónimos. Sencillamente es una forma de determinar las características individuales de cada ADN.


El ADN es el  código de programación de la vida, en su estado natural, se compone de dos hebras, cada una consistente de unidades llamadas ‘nucleótidos’ (los cuatros nucleótidos básicos son adenina, guanina, timina y citosina, abreviados como A, G, T, C). El orden de estos nucleótidos forma ‘genes’ equiparables a un comando de computadora. Estos genes pueden determinar el color de cabello o de los ojos de una persona, las características del pelaje de un animal o si una planta es mono o dicotiledónea. Podemos observar que el 99.7% de las secuencias de ADN de una especie se comparte entre miembros de esta, pero basta ese 0.3% para poder diferenciar e identificar a un individuo. Aunque este porcentaje parece pequeño en realidad representa unos ¡10 millones de nucleótidos! [Butler, 2010, pg. 28-29].


Utilizando esta característica de variación del ADN o ‘polimorfismo’, se desarrollaron muchas técnicas para caracterizar la identidad humana, yendo desde los RFLP’s (Restriction Fragment Length Polymorphism), a los controversiales SNP’s (Single Nucleotide Polymorphism), y la más comúnmente utilizada basada en STR’s (Short Tandem Repeat) para finalizar en el método emergente de la NGS (New Generation Sequencing). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


 

Los STR’s son regiones de ADN con unidades de repetición pequeñas (normalmente de entre 2 y 7 nucleótidos). El número de repeticiones en los marcadores STR, se ha vuelto un identificador característico entre individuos. Estos marcadores pueden identificarse vía PCR (Polymerase Chain Reaction), una técnica de biología molecular que selectivamente amplifica una región específica del ADN haciéndola detectable. No todos los marcadores STR pueden ser utilizados con fines forenses. En noviembre de 1997, la base nacional de ADN conocida como CODIS (Combined Index System) patrocinada por el FBI (United States’ Federal Bureau of Investigation) publicó 13 loci centrales [Butler, 2010, pg. 154-155]. En enero de 2017, estos 13 loci originales se expandieron a 20 marcadores STR [Butler & Willis, 2019, pg. 1].

Existen varios kits comerciales disponibles para la tipificación de los STR’s, método estándar en la identificación forense, proceso que puede hacerse totalmente de forma automatizada. Los pasos en el flujo de trabajo del laboratorio consisten en: extracción del ADN, amplificación por PCR, separación de los fragmentos, detección e identificación alélica [Butler & Willis, 2019, pg. 2]. El método más comúnmente utilizado en la separación es la Electroforesis Capilar (CE). Este método mide la longitud de los productos de la PCR. La NGS, también conocida como Secuenciación Masiva Paralela (MPS) es una técnica alternativa a la electroforesis capilar dentro de la comunidad forense. Este método es preferido por el alto rendimiento de las muestras y porque provee una dimensión adicional, es decir, secuencias de ADN, una mayor cantidad de información por muestra y puede llegar a realizarse paralelamente a los STR’s o a los SNP’s [Butler, 2019, pg. 3].

Cada campo tiene sus propios riesgos intrínsecos. Debido a la naturaleza del trabajo forense, los laboratorios de genética forense comúnmente están plagados de muestras que no tienen las condiciones ideales. Las llamadas ‘evidencias’ pueden haber estado expuestas a condiciones ambientales adversas por periodos de tiempo largos, resultando en una variedad de problemas como degradación del ADN, insuficiencia y/o contaminación del material por otras fuentes. Los restos pueden haber sido movidos, dejados a la intemperie o sepultados por mucho tiempo antes de haber sido localizados. Las muestras recolectadas de las escenas del crimen pueden ser una gota de sangre que se dejó secar por días, o trazas de saliva en un vaso.

Una de las razones por las que los análisis basados en RFLP’s fueron sustituidos por los métodos basados en STR’s, es porque requieren de una cantidad relativamente grande de muestra de ADN intacto [Butler, 2010, pg. 32], que es difícil de encontrar en los casos forenses. Afortunadamente, con los avances en la ciencia y la tecnología, no es tan fácil eliminar evidencias de ADN debido a la sensibilidad analítica de los equipos que hoy existen. 

Desde una perspectiva de equipo de laboratorio y de proceso, un número de estándares o lineamientos (p.e. ENFSI, SWGDAM), deben seguirse para mitigar estos retos. La automatización del manejo de líquidos requiere de una alta precisión y reproducibilidad inclusive a volúmenes muy pequeños. La fácil operación y la amigabilidad de la programación es benéfica para evitar errores. La trazabilidad de las muestras a través de códigos de barras y el manejo de plataformas que manejan datos son especialmente útiles en el campo forense donde comúnmente hay atrasos y almacenaje de evidencia por largos periodos de tiempo. 

Los termocicladores con ciertas características tales como rampas lineales, calentamiento uniforme a lo largo y ancho del bloque sin efecto de borde, soporte de documentación y seguridad de datos, juegan un papel crucial en la obtención de resultados confiables y reproducibles a partir de una mínima cantidad de muestra. Los fabricantes de kits comerciales tales como Promega optimizan las tazas de rampa de calentamiento y enfriamiento y las temperaturas utilizadas en varios kits de STR utilizando los Mastercycler de Eppendorf [Wieczorek et. al., Promega],  para obtener los mejores resultados. La sensibilidad puede ser aumentada, incrementando el número de ciclos [Gill, 2002, pg. 377-378].

 

El tiempo de ciclado puede verse reducido de las 3 horas habituales a tan solo 17 minutos utilizando un Mastercycler Eppendorf para 96 muestras [Butts & Vallone, 2014, pg. 3055], acelerando la posible resolución de los casos a partir de muestras de una sola fuente. Por lo tanto, la capacidad total de muestras y la rampa efectiva son factores críticos a tomar en cuenta. Por ejemplo, mientras el termociclador más rápido en el mercado actualmente tiene una taza de calentamiento con rampa de 10ºC/s (Eppendorf Mastercycler X50s; con bloque de 96 pozos en plata), otros equipos con rampas similares no necesariamente completan la PCR a la misma velocidad [Gerke & Phang, Eppendorf]. 

Adicionalmente a los instrumentos, se debe tener cuidado con todo objeto en contacto directo con las muestras biológicas. Discutiremos este tópico con más profundidad en la siguiente edición – El destino del ADN en la Biología Forense: ISO 18385 al servicio de los retos del Perfilamiento Genético. 

ISO 18385 al servicio de los retos del Perfilamiento Genético.

 

Sinopsis:

El concepto de ciencia forense existe desde la antigüedad. En la biología forense moderna, los analistas del ADN utilizan las características únicas de las secuencias (p.e. STRs) para generar perfiles del mismo exclusivos para cada individuo, a partir de evidencia biológica colectada de escenas del crimen, víctimas y sospechosos. Conforme el avance de la ciencia y tecnología, los retos en el análisis forense del ADN han sido resueltos uno a uno. Sin embargo, hay una forma más fácil de minimizar la carga de esta tarea demandante es la prevención. Los objetos utilizados en la colección, transporte, almacenamiento, proceso y análisis de las evidencias biológicas en los laboratorios forenses requieren de una selección apropiada para evitar degradación adicional y contaminación, asegurando la generación confiable de resultados y la rápida resolución de los casos. Previniendo el problema de la contaminación del ADN desde un principio puede reducir la pérdida innecesaria de recursos en el análisis del mismo.

 

Palabras Clave: perfilamiento del ADN, contaminación de ADN, ISO 18385, grado forense.

 

En una edición previa - “El destino del ADN en la Biología Forense: Perfilamiento del ADN y consideraciones de los instrumentos analíticos utilizados para ello”, se describió la ciencia y técnicas de generación de perfiles genéticos utilizados en las investigaciones forenses. Progreso e innovación en la tecnología continuamente permiten a los técnicos analizar más muestras utilizando menos ADN, de forma más rápida y con mayor precisión. Sin embargo, el punto determinante de éxito en las pruebas de ADN son las muestras. 

 

Así, se debe tener cuidado con todo objeto que está en contacto directo con las muestras biológicas. Esto incluye hisopos para la colección, recipientes de transporte, almacenaje de las muestras y los insumos utilizados en el procesamiento de las mismas. Las mezclas de ADN, es decir, la mezcla de ADN de más de un individuo es frecuente en especial en asaltos sexuales y casos de confrontación. 

 

El ADN puede ser fácilmente transferido entre sujetos y objetos, siendo una bendición o una causa de confusión. Para bien o para mal, el ADN que permanece en la escena puede hacerlo durante mucho tiempo. Células muertas se generan minuto a minuto sobre nuestra piel y varios estudios demuestran que éstas pueden ser transferidas en periodos cortos de tiempo. El ADN puede ser transferido por una segunda persona que actúa como portador, ¡Esté involucrado o no, en el crimen! Existen datos de recuperación de ADN no portador de más de un portador. Aún más interesante resultan los estudios de persistencia del ADN, algunos demuestran la recuperación de muestras a partir de prendas que ya han sido lavadas, o de aquellas que han permanecido sumergidas por más de una semana en agua y aun así, es posible obtener un perfil genético completo [Butler, 2019, pg. 4-6].

Debido a la facilidad en que se transfiere y a su persistencia, la contaminación con ADN es una los mayores retos en el campo forense. Estudios extensos que investigan fuentes potenciales de contaminación han revelado una larga lista de fuentes como son: brochas, guantes y esponjas [Butler, 2019, pg. 10]. Folders, artículos de computación, muebles, teléfonos son también potencialmente contribuyentes de contaminación en el laboratorio [Taylor et. al., 2016]. El famoso misterio del Fantasma de Helibronn plagó la comunidad forense europea por 17 años, antes de que se revelara que la contaminación de los hisopos de algodón utilizados para la colección de ADN era la responsable de estos casos, catapultando la introducción de la ISO 18385 en 2016.

Este estándar define los requerimientos para los fabricantes de todos los productos a ser utilizados en la colección, almacenaje y análisis de material biológico forense. Su objetivo es minimizar el riesgo de contaminación durante el proceso de fabricación de estos productos (p.e. hisopos, incluyendo contenedores y empaques, tubos y otros insumos de plástico utilizados en el análisis de ADN, trajes desechables, guantes, etc.). Adicionalmente, requiere que los fabricantes tengan una base de datos excluyente para soportar a los laboratorios forenses en caso de contaminación. Aun cuando no es todavía una regulación, para la mayoría de las instituciones forenses el uso de productos certificados como ‘Forensic DNA Grade’, es una buena práctica. Los insumos certificados ISO 18385 pueden minimizar el problema de contaminación con ADN no relacionado, previniendo pérdida de muestras debida a errores analíticos y consecuentemente pérdida de tiempo y recursos tanto humanos como financieros. 

Es importante mencionar que tanto Eppendorf como Promega cuentan con una línea especializada de productos que cumplen con la ISO 18385 y están certificados como ‘Forensic DNA Grade’, haciendo una mancuerna perfecta. Esto se puede identificar fácilmente a través de su etiquetado y certificados de calidad.

En el futuro, podemos esperar progreso en áreas relacionadas con la tecnología del ADN que permitan la solución de más casos y de aquellos que no se han resuelto. Conforme la tecnología MPS madura, su aplicación va a incrementarse. El estudio del ADN mitocondrial (heredado de la madre y que existe abundantemente en la célula, utilizado en muestras altamente degradadas), la epigenética (cambios de fenotipo heredables) y de los SNP’s serán de utilidad en la genética investigativa de la genealogía y el fenotipado [Butler, 2019, pg. 10-11].

 

Inclusive los datos genéticos de parientes lejanos que se encuentran en bases de datos genealógicos han ayudado a resolver casos fríos no resueltos [Butler, 2019, pg. 2]. Hay estudios que analizan componentes genéticos para predecir edad, ascendencia y apariencia (incluyendo cambios debidos al envejecimiento) del dueño de un determinado perfil genético. De tener éxito, los resultados sin duda darán como consecuencia una oleada de técnicas forenses innovadoras que serán especialmente útiles en los casos fríos (p.e. identidades perdidas, restos óseos antiguos, perfil víctima/victimario). 

¡Cuidado criminales! Uds. no pueden verlo, ¡pero los analistas del ADN si pueden!

 

Bibliografía:

  1. Butler, J.M. and Willis, S. (2019) Interpol review of forensic biology and forensic DNA typing 2016-2019. Forensic Science International: Synergy, https://doi.org/10.1016/j.fsisyn.2019.12.002

  2. ISO 18385:2016 Minimizing the risk of human DNA contamination in products used to collect, store and analyze biological material for forensic purposes — Requirements

Taylor, D.A., Abarno, D., Rowe, E., & Rask-Nielsen, L. (2016). Observations of DNA transfer within an operational Forensic Biology Laboratory. Forensic science international. Genetics, 23: 33-49.

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